研究团队通过同源序列检索与系统发育分析，筛选获得多个候选ADO。经异源表达和纯化后，不同来源的ADO（LspADO、PvaADO和CpuADO ）均表现出可检测的芳香烯烃氧化裂解活性，但不同来源的ADO对芳香烯烃底物的转化率存在明显差异。底物谱分析显示（图2），来源于Coniochaeta pulveracea的CpuADO对4-乙烯基愈创木酚、异丁香酚等多种木质素单体衍生物均表现出优异的转化活性（转化率最高超99%），具备极高的改造潜力。

图2. 候选ADO对系列芳香烯烃底物的底物谱初筛结果

为了精准改造，团队解析获得了2.2 Å高分辨率的CpuADO晶体结构（PDB ID: 9LP3）。结构显示，CpuADO呈典型的七叶β-螺旋桨折叠，蛋白主体主要由31条β-链和8个α-螺旋组成，Fe²⁺活性中心深埋于底物通道末端（图3A）。研究对CpuADO的整体结构、活性中心及底物通道进行了系统分析：进一步将CpuADO与已报道的MapADO进行结构叠合，结果显示二者在整体折叠和Fe²⁺配位中心上具有较高相似性，其中，CpuADO中H195、H249、H312和H513四个组氨酸残基参与Fe²⁺配位，MapADO共结晶配体香兰素的位置也为判断底物结合口袋提供了参考（图3B）；对比分析了CpuADO与参照酶MapADO在底物通道形态上的显著差异，可以看出，两种酶均具有由蛋白表面延伸至Fe²⁺活性中心附近的潜在通道，但通道形态、入口位置及周围空间环境存在一定差异（图3C-D）。上述结构信息表明，CpuADO具有保守的金属活性中心，同时其底物通道区域具有可改造空间，为后续围绕底物进入、结合和定位开展结构导向理性设计提供了依据。

图3. CpuADO的结构分析与活性中心构型

注：（A）CpuADO的整体晶体结构，Fe²⁺以橙色球表示；（B）CpuADO与MapADO的结构叠合及活性中心局部放大图，CpuADO和MapADO分别以浅蓝色和粉色显示，MapADO中共结晶配体香兰素以粉色棒状显示；（C）CpuADO的底物进入通道，通道以蓝色显示；（D）MapADO的底物进入通道，通道以洋红色显示。

在明确CpuADO的整体结构和Fe²⁺活性中心后，研究进一步聚焦底物进入活性中心的通道区域。如图4所示，CpuADO活性中心附近存在由蛋白表面通向Fe²⁺附近的潜在底物进入通道。图4A展示了Fe²⁺、配位组氨酸残基、对接的芥子醇及候选突变位点之间的空间关系；图4B从通道入口方向展示了突变残基在底物通道附近的分布。通过对比分析，研究锁定了位于底物通道入口及活性中心附近的多个关键氨基酸残基（如W338、F349、R352、M247和N42等）, 这些残基的空间位阻和电子环境，被认为是调控底物进入和定位的关键“开关”。因此，这些位点被作为后续结构导向理性设计和突变体构建的重要候选位点。

图4. CpuADO活性中心及底物通道附近结构改造位点分布

注：（A）CpuADO活性中心剖面图，显示Fe²⁺、配位组氨酸残基、对接的芥子醇及候选突变位点；（B）底物通道俯视图，显示通道入口及突变残基的空间分布。

基于晶体结构，团队展开了双重改造策略：1) 结构导向理性设计：研究团队围绕Fe²⁺活性中心及底物通道入口附近残基开展丙氨酸扫描和定点突变。结果表明，H195、H249、H312和H513等Fe²⁺配位组氨酸残基对CpuADO催化活性至关重要；同时，部分非配位残基突变后也会导致活性下降，表明CpuADO的催化性能不仅依赖金属配位中心，也受到底物通道和活性中心外围残基共同影响。表1和2显示，针对芥子醇（底物11）（天然低效底物），通过定点突变获得F349W突变体，其催化效率（kcat/Km）提升至野生型的1.41倍，是结构导向理性设计中最具代表性的有益突变体。W338D则对多个底物表现出更广谱的提升趋势，例如对底物1、8、9和10的转化率分别由WT的19.7%、37.8%、80.5%和12.0%提高至 30.3%、50.0%、98.4%和16.3%。2）AI辅助筛选： 引入SaProt 650M零样本预测模型，对数十万种潜在突变进行虚拟筛选，成功捕获关键突变体W338D。 W338D则表现出更明显的底物依赖性提升：其对异丁香酚（底物9）的催化效率提升至野生型的12倍；对 4-乙烯基愈创木酚（底物8）和松柏醇（底物10）的催化效率分别提升至野生型的1.73倍和1.33倍。

表1. CpuADO-WT及突变体对不同底物的转化率（%）

注：底物编号与图2一致。

表2. CpuADO-WT及突变体的稳态动力学参数

注：底物编号与图2一致。8，4-乙烯基愈创木酚；9，异丁香酚；10，松柏醇；11，芥子醇。

为解释突变体催化效率变化的结构基础，研究团队采用分子动力学模拟（MD）分析和阐释突变效应的结构基础。如图5所示，W338D突变优化了底物在活性口袋中的空间取向，显著缩短了Fe²⁺与底物C=C双键的距离，从而大幅降低了反应能垒，加速了氧化反应进程。

图5. CpuADO突变体与芥子醇的分子动力学模拟分析

注：（A）-（D）为F349V、R352K、F349W和W338D与芥子醇的100 ns模拟结合构象；（E）Fe²⁺-C=C距离随模拟时间变化；（F）蛋白骨架RMSD变化。

为验证有益突变的普适性，研究将CpuADO中的关键位点迁移至同源酶TthADO中。结果如图6显示，突变位点F335D和R352K均表现出积极的改造效果：F335D对6种测试底物的转化率实现了1.12-1.65倍的全面提升；R352K亦显著增强了其对底物1、8、9和10的催化能力（提升幅度达1.38-1.67倍）。值得注意的是，R352K对底物5的转化率降至野生型的0.67倍，表明突变位点的跨酶系迁移效果具有底物依赖性。这种差异可能源于不同同源酶在活性中心微环境、底物通道立体空间以及底物结构差异上的协同作用。

图6. CpuADO有效突变位点在TthADO中的验证

本研究综合运用新酶挖掘、结构生物学、理性设计及AI辅助筛选策略，系统研究了来源于Coniochaeta pulveracea的芳香双加氧酶 CpuADO，并获得了催化效率提升的代表性突变体。研究拓展了ADO酶资源，解析了CpuADO的2.2 Å高分辨率晶体结构，明确了其Fe²⁺-4His金属活性中心和潜在底物通道。

基于结构信息，F349W提高了CpuADO对芥子醇的催化效率，体现了结构导向理性设计在低效底物改造中的作用；进一步结合AI辅助筛选，W338D对异丁香酚、4-乙烯基愈创木酚和松柏醇等底物均表现出催化效率提升，其中对异丁香酚的kcat/Km提高约12倍。该研究为芳香双加氧酶的结构功能分析和理性改造提供了结构模板，也为木质素单体相关芳香烯烃的绿色生物催化转化提供了新的酶工具。

相关研究成果以“Structure-Guided Engineering of an Aromatic Dioxygenase from Coniochaeta pulveracea for Improved Catalysis of Lignin-Related Aromatic Olefins”为题发表于《Green Chemistry》。论文共同第一作者为华南理工大学余垒博士、马云建副研究员，通讯作者为华南理工大学吴斌博士、王永华教授。该研究工作得到了先进造纸与纸基材料全国重点实验室自主研究课题基金（2025ZD05）等的资助。

论文链接：https://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/2026/GC/D6GC00126B