一、研究背景
转酯化反应（又称酯交换反应）作为有机合成中的经典核心转化策略，通过置换酯分子中的酰基基团来构建新型酯类化合物，在医药、香料与生物能源等领域的合成中具有关键作用。传统化学催化路径通常依赖无水或非质子性溶剂条件进行操作，因为水相环境中普遍存在的竞争性水解副反应会显著降低转化效率，并可能引发环境污染，这一瓶颈长期制约了水相转酰基合成的绿色化学与生物制造的发展，尤其在医药与香料中间体合成等水相反应需求突出的领域更为明显。
相对于采用有机溶剂或复杂的保护基策略来规避水相中酯交换反应易受水解干扰的难题，生物催化为破解水相中酯交换与水解的竞争困境提供了新思路。然而，现有生物酶催化剂（如酰基转移酶MsAct）介导的反应仍然受水解作为主要副反应的限制，需要严格的动力学控制以减轻产物损失。因此，开发一种在水相中能完全避免水解的转酯催化剂成为生物酶催化领域的重要挑战。
近日，华南理工大学食品科学与工程学院、先进造纸与纸基材料全国重点实验室马云建副研究员、王永华教授等通过蛋白质工程改造，成功将一种来自Phanerochaete chrysosporium菌的醇氧化酶（PcAOx）转化为一种在水相介质中具有卓越转酯化活性且完全避免水解副反应的新型生物酶催化剂—PcAOx-VPN突变体。该突变体因其高度疏水的活性中心能有效排斥水分子，从而在水环境中实现高效、专一地酯交换催化，突破了传统方法因水解竞争而难以在水相中进行的限制，为绿色生物催化提供了新策略。
二、图文解读
1、PcAOx-VPN突变体的设计与催化酰基转移反应活性的发现
研究团队以野生型PcAOx的晶体结构（PDB: 6H3G）为指导，针对活性位点入口处可能阻碍大体积底物进入的三个关键残基（M59, Q60, R61）进行了饱和突变。通过筛选，获得了三重突变体M59V-Q60P-R61N（即PcAOx-VPN）。该突变体显著拓宽了底物谱，对苯甲醇等大位阻醇的氧化活性比野生型提高超过10倍，其结构基础在于M59V突变导致色氨酸W560构象外翻，在黄素辅因子上方创造了额外空间（图1）。
图1. 突变体PcAOx-VPN（青色，PDB: 9V6K）与野生型PcAOx（灰色，PDB: 6H3G）的结构比较
该突变体不仅显著拓宽了对大体积醇类的氧化底物谱，更为重要的是该突变体意外地获得了全新的、高选择性的转酯化活性（图2）。与MsAct等已知水相转酯催化剂相比，其核心优势在于高度疏水的活性中心能有效排除水分子，在动力学上完全抑制了水解副反应，从而解决了水相转酯反应中长期存在的选择性难题。
图2. 不同乙酸乙烯酯浓度对2-苯乙醇酯化反应的影响
左图：酯形成的反应时间曲线；右图：不同试剂浓度下的初始反应速率。
2、氧化态PcAOx-VPN催化转酯反应
鉴于PcAOx-VPN是一种黄素依赖型酶，酶结合的FAD基团的氧化状态可能会影响其转酯化活性。为此，研究团队研究了还原态和氧化态PcAOx-VPN的转酰基酶活性（图3）。在厌氧反应条件下，并以可氧化的苄醇作为酰基受体，在存在乙酸乙烯酯（酰基供体）的情况下，经过4小时的孵育未观察到苄基乙酸酯的形成。将O2引入反应混合物后，观察到黄素辅因子的快速再氧化（也可通过典型黄色的重新形成看到），同时苄基乙酸酯的形成开始发生。可见FAD辅基的氧化还原状态（还原态 vs. 氧化态）显著影响PcAOx-VPN酶的转酯催化活性。
图3. FAD氧化还原状态对PcAOx-VPN转酯活性的影响
3、PcAOx-VPN不催化酯水解
该突变体最突出的特性是完全丧失了酯水解活性，即使长时间孵育也检测不到苄基乙酸酯的水解，且仅能在特定条件下发生转酯反应（图4）。这归因于其活性中心由F101、Y407、W560、H561等芳香族残基构成的高度疏水环境，能有效排斥水分子进入催化中心，此外还有同样疏水的M103，这些共同赋予了活性位点明显的疏水特性。PcAOx-VPN的晶体结构（PDB: 9V6K）和通道分析均证实了活性位点及通道的强疏水性，从动力学上完全阻断了水作为亲核试剂的竞争，从而解释了其独特的选择性催化行为。
图4. PcAOx-VPN水解活性的研究
4、PcAOx-VPN的催化底物范围
PcAOx-VPN的底物范围评估表明，其偏好小分子酰基供体（如乙酸乙烯酯）和脂肪族伯醇，对（S）－对映体具有高度选择性。醇的链长以4-5个碳最佳，并能催化α,ω-二醇的单/双乙酰化。此外，该酶也能接受苯甲醇衍生物、胺和硫醇作为亲核试剂，但较大的底物（如2-苯乙基乙酸酯）会导致产率降低。以上结果表明，该酶尤其适用于中小分子量酯的对映选择性合成，为在水相中进行绿色、高效的手性酯类生物合成开辟了新的生物催化途径，而对大体积底物的有限活性提示其活性中心空间可能相对受限，未来或可通过酶工程进一步优化。
图5. PcAOx-VPN的催化底物谱
5、PcAOx-VPN催化酰基转移反应机制初探
PcAOx-VPN转酯化活性的核心催化机制依赖于活性位点的关键残基。His561和Asn604构成的催化二元体可能通过活化醇羟基并稳定四面体中间体，对反应至关重要，这与其在氧化机制中的作用相似。同时，M59A/V突变通过扩大活性口袋空间，显著增强了酶的转酯活性。其他残基如H561和N601也对酶的催化功能有调节作用。整体而言，该活性源于醇氧化酶固有的催化特性——其活化羟基的过程同步提升了亲核性，使其能够进攻酯羰基，而氧化态FAD的参与进一步维持了活性位点的催化微环境，其具体作用机制尚不明确，可能与维持活性位点静电势有关。
图6. 野生型PcAOx及其部分突变体的转酯化活性
图7. 关于His561和Asn604机制作用的假设
6、VPN突变模式的普适性
重要的是，这种转酯化活性并非PcAOx-VPN所独有，研究表明，在ParAOx、AflAOx等同源醇氧化酶中引入相应“VPN”突变模式后同样获得转酯化能力（图8），且其活性中心的组氨酸残基同样关键。表明该转酯化活性可能是黄素依赖型醇氧化酶家族中一种通过理性设计即可“唤醒”的“隐藏功能”，而非单一酶的特有性质。这一发现突破了该类酶仅催化氧化反应的传统认知，极大地拓展了生物催化工具箱，为未来在水相中定制化合成特定结构的酯类分子奠定了坚实的基础。
图8. 不同来源AOx突变体的转酯化活性验证
三、研究总结
本研究通过理性蛋白质工程改造，成功将黄素依赖型醇氧化酶PcAOx转化为一种在水相中高效、无水解副反应的转酯催化剂，其关键突变体PcAOx-VPN展现出两大突破：显著拓宽了底物谱，并对苯甲醇等大位阻醇的氧化活性提高超过10倍；更重要的是，它意外获得了全新的、高选择性转酯化活性。该活性的核心在于其高度疏水的活性中心能有效排除水分子，从而在动力学上完全抑制水解副反应，解决了水相转酯反应的选择性难题。从机制看，原有的醇氧化催化双元体被重用于活化醇底物并稳定过渡态，而氧化态FAD的参与对维持活性至关重要。这一“混杂活性”的发现，突破了醇氧化酶的固有功能认知，拓展了黄素酶催化边界。该活性具有普适性，在同源醇氧化酶中引入相应“VPN”突变后同样获得转酯化能力，在合成规模实验中实现62%的分离产率，展现出工业化应用潜力。此项工作不仅为在水相中进行绿色、高效的酯类生物合成开辟了全新途径，也揭示了通过挖掘氧化酶“隐藏功能”以拓展生物催化工具箱的广阔潜力。
四、论文信息
相关研究成果以“Engineered alcohol oxidases catalyse transesterification in aqueous media without competing hydrolysis”为题发表于《Nature Communications》。论文第一作者为华南理工大学吴斌博士，共同通讯作者为华南理工大学马云建副研究员、王永华教授和荷兰代尔夫特理工大学Frank Hollmann教授。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-026-68899-y