生物聚合物Coil-Helix转变是一种重要的二级结构重建过程，它调控着广泛的生物功能，如增强蛋白质与配体的结合、调节多肽的跨膜活性等。近几十年来，化学家以及生物学家们在热力学平衡态下对多肽的构象转变及其性能进行了广泛的研究。相比之下，生物系统则是通过消耗化学能量（ATP、GTP）在非热力学平衡态下运行，从而获得更加复杂的结构和功能(自我适应、自我愈合、自我复制等)。例如，生物体利用化学能量分子GTP来驱动微管蛋白进行有序的组装与解组装，从而动态地形成微管结构来协助完成复杂的细胞过程，包括细胞分裂、胞内运输等。因此，在非热力学平衡态下设计并构筑化学能量驱动的具有自主进化行为的多肽系统，对理解与模拟生物系统中蛋白质的动态行为，发展智能、适应性的生物材料具有重要的科学意义。 

肽Coil-Helix构象转变是一种重要的二级结构重建过程，在生物系统中发挥着至关重要的作用。受此启发，华南理工大学软物质研究院张维研究员和张睿研究员等人设计了一个可逆的化学反应网络，在非热力学平衡态下，利用化学能量驱动多肽在无规卷曲与α螺旋结构之间进行动态转变。此外，通过动力学计算并结合CD实验表明，瞬态α螺旋结构的寿命及其螺旋含量可通过化学反应网络中的亲核试剂以及化学燃料的输入来进行调控。  

在本研究中，作者所选用的多肽衍生物为聚谷氨酸（PLG），当其侧链羧基被质子化后，它在溶液中将以α-螺旋的形式存在。然而，当其所处溶液的pH值高于6.5时，其侧链羧酸基团将脱去质子而携带负电荷，由于电荷排斥作用将以无规卷曲的结构存在。作者在pH为6.5的缓冲液中设计了一个可逆的化学反应网络，在化学能量EDC的驱动下，PLG侧链携带负电荷的羧酸根将被转化为亚稳态的NHS-酯，从而减弱其侧链之间的电荷斥力，促使PLG构象从无规卷曲向α螺旋进行转变。随着化学能量EDC的消耗，PLG侧链携带的亚稳态NHS-酯将逐渐水解而恢复至初始状态，多肽构象也由α螺旋重新恢复到无规卷曲状态，整个过程的净反应为化学能EDC水解为EDU（图1）。

图1 本文研究思路示意图

　　作者首先以简单的己酸为模型化合物，利用HPLC对所设计的化学反应网络进行原位的监控与分析。在pH=6.5的缓冲液中，依次加入己酸、亲核试剂NHS以及脱水剂EDC后，通过实时HPLC分析发现，体系中的羧酸基团将逐渐转变为相应的酯基，亚稳态中间体NHS-酯的浓度逐渐增加并达到峰值，随着脱水剂EDC的消耗，这种亚稳态的NHS-酯又逐渐水解，体系恢复至初始状态，整个过程持续5个小时左右。HPLC定量分析表明在此条件下亚稳态NHS-酯的最大转化率约为30%（图2a）。

图2 （a）利用HPLC监控化学反应循环过程中戊酸-NHS酯的浓度随时间变化趋势图；（b）多肽衍生物在化学反应循环过程中不同时间的红外光谱图

　　随后作者利用红外光谱对此过程进行研究，多肽衍生物PLG自身在1620-1680 cm^-1以及1520-1580 cm^-1表现出两个较强的酰胺I、酰胺II的吸收谱带。将PLG以及NHS（2 eq.）置于pH=6.5的缓冲液中，加入化学燃料EDC来启动化学反应循环，并通过红外光谱对体系不同时间的组分进行分析。研究发现，在30 min时体系中的多肽衍生物在1814、1784、1737 cm^-1处呈现出三个新的红外吸收峰，对应于NHS-酯的C=O双键吸收峰，说明了亚稳态产物NHS-酯的形成。随着时间的延长，新形成的NHS-酯的三组红外吸收峰消失，体系中多肽衍生物的红外光谱又恢复至初始状态，进一步说明了所设计的化学反应网络的可行性（图2b）。 

　　圆二色谱（CD）测试发现，PLG在pH=6.5的缓冲液中于196 nm处呈现出明显的负CD信号，说明PLG以无规卷曲的结构存在。当向体系中加入亲核试剂NHS以及化学能EDC后，通过原位CD实时监控发现，在196 nm处负的CD信号逐渐向208 nm处移动，并在222 nm处出现一个新的CD信号峰（图3a）。在30分钟时，-[θ]222的数值达到最大，此时该瞬态系统的最大螺旋度约为38%。随着时间的延长，体系的CD信号逐渐又恢复至初始状态（图3b）。不仅如此，研究发现在体系的CD光谱恢复至初始状态后，再次添加化学能EDC，体系中多肽的构象将再次发生可逆变化，该循环可至少重复三次（图3c）。

图3 化学能驱动过程中多肽构象变化示意图

　　通过化学反应网络的动力学计算，作者发现调节化学燃料和亲核试剂的浓度可以有效地控制Coil-Helix转变的动力学过程。在保持其它条件不变，逐渐改变EDC浓度时，体系中的NHS-酯的转化率随着EDC的浓度增加而增加，当EDC浓度达到3当量时，NHS-酯的转化率达到最大值（图4a, b）。与此同时，系统的寿命也将延长（图4c）。而在改变NHS浓度（0.25 eq.至12.00 eq.）的过程中，体系的转化率也将随着NHS的浓度增加而逐渐增加，但系统的寿命并不会受到明显的影响（图4d-f）。

 图4 通过反应动力学模型计算化学反应循环中NHS-酯浓度以及体系的寿命的变化趋势

　　随后，作者系统地改变反应网络中EDC以及NHS的初始浓度，通过CD光谱对体系的最大螺旋度以及寿命进行研究。结果表明，在逐渐改变EDC的浓度时（0.25 eq.至2.00 eq.），体系的最大螺旋度逐渐增加，并在EDC初始浓度为3当量时达到最大（~55%）。在EDC浓度增加过程中，体系的寿命将明显延长（图5a-c）。类似的，在NHS初始浓度改变过程中，体系的最大螺旋度也将随着NHS初始浓度的增加而逐渐增大并达到峰值。但是，瞬态α螺旋结构的寿命几乎不受影响（图5d-f），与动力学计算结果相吻合。

 图5 改变化学能以及亲核试剂的初始浓度时，通过CD光谱监控体系最大螺旋度以及寿命的变化

Wang Zeng, Che Fan, Xupu Xing, Hao Cheng, Huimin Fu, Bingxu Ma, Ziqiong Yang, Rui Zhang, Wei Zhang 

Giant 2021, 7, 100067

https://doi.org/10.1016/j.giant.2021.100067

链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2666542521000230?via%3Dihub