陈庭坚教授团队在Nat. Commun.发表论文：非天然核酸聚合酶利用扩展遗传字母实现RNA与2'-修饰核酸的精准标记

 近日，华南理工大学生物科学与工程学院陈庭坚教授团队在工程化改造非天然核酸聚合酶及非天然碱基对的应用领域取得重要进展。团队系统评估了工程化改造得到的非天然核酸聚合酶突变株SFM4-6对各种非天然碱基对、天然-非天然碱基错配碱基对及其它多种修饰底物的识别活性，基于此实现了兼具非天然糖/磷酸骨架和非天然碱基的核酸分子的高效酶促合成，并成功开发了一整套基于非天然核酸聚合酶和非天然碱基的RNA及2'-修饰核酸位点特异性标记的系统策略，可应用于各种5'-末端、3'-末端、序列内部单一位点及多位点精准标记的功能性RNA及2'-修饰核酸分子（包括但不限于RNA、2'-F-RNA、2'-F/OMe-RNA及2'-OMe-RNA的反义寡核苷酸、siRNA、核酸适配体、核酸适配体传感器及基因编辑的向导寡核苷酸）的高效制备。该成果发表在国际顶级期刊Nature Communications上，题目为“Engineered polymerase-mediated efficient synthesis of site-specifically functionalized RNA and 2'-modified RNA oligonucleotides via genetic alphabet expansion”。博士后吴静、硕士研究生梅隽彦和博士研究生陈志鹏为论文的共同第一作者，陈庭坚教授为唯一通讯作者，华南理工大学生物科学与工程学院为唯一完成单位。

天然核酸分子（DNA和RNA）的碱基序列仅由A、T/U、C、G四种碱基构成，这极大地限制了其序列与功能的多样性；同时，有限的糖/磷酸骨架种类也严重限制了天然核酸分子的结构、性质及其相应的功能。含有各种非天然碱基对和糖/磷酸骨架修饰的非天然核酸分子的开发，显著地扩展了核酸分子的序列、结构、性质和功能的多样性，为核酸分子的广泛应用提供了重要的基础。而高效的非天然核酸聚合酶则是非天然核酸分子获得广泛应用的一个重要前提。团队在前期的研究工作中，已经成功开发出多种可以高效合成、反转录和复制含有各种糖/磷酸修饰骨架的非天然核酸聚合酶突变株。然而，这些非天然核酸聚合酶突变株对于各种非天然碱基对的识别活性，以及兼具非天然碱基和糖/磷酸修饰骨架核酸分子的酶促合成及应用，尚未得到系统深入的探索。

 本研究首先系统评估了工程化改造获得的非天然核酸聚合酶突变株SFM4-6对非天然碱基对和天然非天然碱基错配碱基对的识别及合成活性，在此基础上开发了酶促合成兼具非天然碱基和非天然糖/磷酸骨架核酸分子的技术，以及“受控暂停-重启引物延伸”策略，实现了各种位点特异性标记/功能化RNA及2'-修饰RNA寡核苷酸的高效制备。各种位点特异性标记/功能化的功能性RNA及2'-修饰RNA寡核苷酸制备技术的建立及应用展示包括如下一些方面：（1）5'-非天然碱基标记寡核苷酸链的制备。团队利用SFM4-6催化合成天然-非天然碱基错配碱基对的活性，开发了“受控暂停-重启引物延伸”策略，先在引物的3'-端（合成寡核苷酸链的5'-端）引入带功能基团的d/rTPT3衍生物，再完成至全长的引物延伸，经DNA引物和模板的酶降解及与功能性分子的偶联反应，实现5'-端精准标记的RNA及2'-修饰RNA寡核苷酸的制备。该方法操作简便、兼容性强，具有良好的可控性。（2）5'-荧光标记功能性siRNA的高效制备。以天然DNA为模板，通过上述策略在引物的3'-端（合成寡核苷酸链的5'-端）引入dTPT3Am残基并完成引物延伸，经DNA引物和模板的酶降解、与荧光分子的偶联及双链的退火组装，获得5'-荧光标记的完整siRNA。对稳定表达GFP的B16-OVA细胞的转染及干扰实验表明，该siRNA可高效进入细胞，其沉默基因表达效率超过90%。该方法为siRNA的可视化追踪与功能研究提供了有力工具。（3）单一标记/双标记2'-F-RNA及2'-F/OMe-RNA核酸适配体/核酸适配体传感器的制备。一方面，应用前面建立的策略成功制备了5'-端荧光标记的2'-F-CU-RNA及2'-F/OMe-RNA适配体。这些核酸适配体与各自靶标（人α-凝血酶和金属β-内酰胺酶）的结合活性完全保持，证明了该方法与被标记寡核苷酸分子原有功能与活性的良好兼容性。另一方面，团队进一步建立了双标记策略，成功构建了5'-Dabcyl/3'-FAM双标记的2'-F-CU-RNA核酸适配体传感器，并证实其可有效应用于人α-凝血酶的检测，从而为生物传感领域提供了新的检测工具及检测工具制备技术。

 本研究首次将非天然碱基与2'-修饰核苷酸两类非天然核酸元件系统整合于同一技术平台，建立了基于非天然核酸聚合酶SFM46和非天然碱基d/rTPT3衍生物的新型核酸标记系统策略。所开发的各项标记核酸酶促制备技术不依赖于特殊的仪器，在普通的生物实验室利用常规易得的试剂和设备即可完成各种目标标记核酸分子的快速高效制备，制备获得的标记功能核酸分子的应用与主流的检测仪器和平台兼容，为功能性核酸的制备及位点特异性标记、新型核酸分子进化（如SELEX）及生物医学检测工具的开发与应用提供了稳定、高效且易于推广的技术方案，具有重要的科学意义和广阔的转化应用前景。

 本研究得到了国家自然科学基金、国家重点研发计划“合成生物学”重点专项、广东省“珠江人才计划”青年拔尖人才项目以及广东省“珠江人才计划”引进创新创业团队项目的支持。