张雷教授团队在ACS Catal.发表论文：工程化酮还原酶用于角鲨胺关键中间体的高效绿色生物制造
角鲨胺（Squalamine）是一种从大白鲨肝脏中分离得到的广谱抗生素，具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒以及治疗神经退行性疾病的巨大潜力。然而，其化学合成路线步骤繁琐、立体选择性差、总产率低，特别是关键中间体——7α,24R-二羟基-5α-胆甾烷-3-酮的构建一直是有机合成中的难点。
近日，我院张雷教授团队利用来自Novosphingobium aromaticivorans的工程化酮还原酶（NaKRED），结合化学合成，仅用三步就以61.0%的总产率高效合成了角鲨胺的关键中间体。优化反应条件后，在10 mM底物浓度下，产物滴度达到2.153 g/L，立体选择性完全保持，高达99.8%。相关成果以Chemo-Enzymatic Synthesis of a Squalamine Intermediate by an Engineered Ketoreductase from Novosphingobium aromaticivorans为题发表于国际权威期刊ACS Catalysis。
论文链接： https://doi.org/10.1021/acscatal.6c03102
图1 三步化学-酶法合成路线及立体选择性验证结果
1. 野生型NaKRED的蛋白质工程改造
图2A展示了野生型NaKRED活性口袋中底物1a（深青色）与NADH的对接构象，关键催化残基Ser139、Tyr152、Lys156围绕底物排列，底物C24羰基与NADH C4的距离为4.1 Å（紫色与蓝色球体），超出了高效氢负离子转移的理想范围，解释了野生型仅41.9%转化率的结构基础。图2B以示意图还原了催化机制：NADH C4位的氢负离子向底物C24羰基发起亲核攻击，Tyr152作为质子梭转移质子，生成手性醇产物，为后续理性设计突变以缩短催化距离提供了理论依据。
图2 野生型NaKRED活性口袋中底物与NADH的对接构象及催化机制示意
2. 优化确定最佳反应参数，10 mM底物浓度下实现2.153 g/L产物滴度
图3A-D分别展示了NAD+、NADH、GDH和NaKRED四个参数的正交优化结果，确定最佳组合为：NAD+ 1.0 mM、NADH 0.05 mM、GDH 50 g/L、NaKRED 80 g/L。图3E显示随底物浓度从1 mM逐步提升至10 mM，产率从约94.0%缓慢降至51.2%。图3F对应展示了产物滴度的变化趋势，在10 mM底物浓度下达到2.153 g/L，实现了克级每升的制备规模，且立体选择性全程保持在≥99.8%，为工业化放大奠定了基础。
图3 反应条件优化及底物浓度放大实验结果
3. Y199A/N149L双突变将催化距离从4.1 Å缩短至3.2 Å，并首次揭示NADH构象调控机制
图4A将野生型（绿色）与Y199A/N149L双突变体（青色）的游离态晶体结构叠加，显示两者整体折叠高度相似，差异仅集中在Helix6区域（红圈），表明突变未破坏蛋白质整体结构完整性。图4B首次揭示NADH的双构象调控机制：绿色A-构象中烟酰胺环取向正确，支持高效催化，对应八聚体活性态；青色B-构象为非生产性取向，对应四聚体非活性态，证明NADH兼具氢负离子供体与变构效应器双重功能。图4C展示双突变体活性中心细节：Y199A扩大底物通道入口，N149L增强疏水堆积，使底物C24羰基与NADH C4距离从野生型的4.1 Å缩短至3.2 Å，为高效催化创造了理想几何条件。
图4 野生型与突变体，NAD+键合的突变体晶体结构及NAD+构象调控活性中心结构
4. 催化机制研究
图5A-C的RMSD曲线显示：野生型波动较大，Y199A单突变体RMSD升高且波动明显，而Y199A/N149L双突变体RMSD最低（2.50±0.07 Å）且最稳定，表明双突变有效补偿了单突变的结构扰动。图5D-F的二维密度图定义了催化前态标准：野生型仅3.40%时间处于催化前态，Y199A单突变体为11.55%，Y199A/N149L双突变体高达19.48%（野生型5.7倍），直接解释了kcat/KM提升6.2倍的动力学数据。图5G-I显示底物通道体积：野生型523.9 Å3，Y199A扩大至645.4 Å3（+23.2%），双突变体为578.6 Å3，表明N149L突变适度收窄了过度扩张的通道，在保证底物进入的同时维持了精准定位能力，实现了“既进得来、又放得准”的最优平衡。
图5 分子动力学模拟揭示突变体催化效率提升的分子基础
本研究成功建立了三步化学-酶法合成角鲨胺关键中间体的高效路线，总产率达61.0%，立体选择性99.8%。通过蛋白质工程获得的Y199A/N149L双突变体将转化率提升至94.3%，晶体结构与分子动力学模拟揭示其机制在于扩大底物通道、缩短催化距离至3.2 Å，使催化前态概率提升5.7倍。研究首次发现NADH存在A/B双构象调控催化活性，拓展了对其作为变构效应器的认知。