近日，华南理工大学生物科学与工程学院陈庭坚教授课题组在含非天然碱基DNA的等温扩增方法开发及其应用的研究上取得新突破，相关成果发表在国际顶级期刊《Journal of the American Chemical Society》（IF=15.6）上，题目为：“Rolling Circle Amplification with an Expanded Genetic Alphabet (ExRCA) Generates DNA Materials Incorporating Additional Building Blocks for Enhanced Programmable Functionalization”。该研究通过设计建立一种使用扩展遗传字母表的滚环扩增技术 (rolling circle amplification with an expanded genetic alphabet，简称ExRCA), 在恒温下实现了含非天然碱基DNA的快速大量扩增，并探索展示了该技术的多种应用，特别是在五/六碱基DNA功能材料构筑中的应用。博士研究生彭乐丽为论文的第一作者，陈庭坚教授为论文的唯一通讯作者，华南理工大学生物科学与工程学院为唯一单位。

 (论文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.5c03404)

 近年来，非天然碱基对（unnatural base pairs, UBPs）的开发显著扩展了遗传字母表，使DNA能够承载更多的遗传信息与功能，在合成生物学中展现出了巨大的应用潜力。其中，dNaM-dTPT3是目前应用最广泛的代表性非天然碱基对之一，已经被成功应用于具有扩展遗传字母的半合成生命体的构建。然而，如何高效扩增和全面利用含有非天然碱基的DNA仍是该领域的重要挑战。

 图1. 使用扩展遗传字母表的滚环扩增（ExRCA）技术及其应用

 针对这一问题，团队首先探索验证并系统表征了phi29 DNA聚合酶复制非天然碱基对dNaM-dTPT3及其功能化类似物的活性，并提出了三种含非天然碱基DNA环状模板的制备策略，为后续各方法的建立奠定了基础。在此基础之上，团队建立了使用扩展遗传字母表的滚环扩增（ExRCA）技术，并进一步开发了其多引物扩增的版本 (ExMRCA)，实现了含非天然碱基DNA的高效等温扩增。

 基于ExRCA和ExMRCA技术，团队进一步实现了含有非天然碱基（对）的单链和双链DNA的大规模制备，并展示了含有非天然碱基的单链DNA产物在构建位点特异性标记的DNA四面体中的应用，从而展示了这些技术在DNA纳米材料制备中的重要价值。接着，团队利用在ExRCA产物中周期性引入的功能化非天然碱基，实现了对目标分子检测信号的可控高效放大，建立了超高灵敏度的生物分子检测方法。同时，团队还展示了ExRCA技术在高效制备各种通过非天然碱基进行定点荧光标记/功能化或蛋白质固定化的DNA水凝胶中的应用。此外，团队充分发挥ExRCA产物中功能化的非天然碱基与天然DNA功能序列的功能正交独立且可以协同作用这一优势，通过设计不同的滚环扩增环状模板制备出了各种天然DNA功能序列与功能化的非天然碱基具有特定比例的超长串联重复序列，从而构建出多种新型的DNA功能材料并展示了它们的应用，例如：（1）构建了各种含有等比靶标特异性DNA适配体和荧光标记非天然碱基的多价DNA探针，并展示了它们在靶标细胞特异性标记和成像中的应用；（2）构建了一种含有等比具有类过氧化物酶活性G-四链体/血红素和偶联葡萄糖氧化酶的非天然碱基的DNA级联反应催化剂，并展示了它在葡萄糖灵敏检测中的应用。实验结果充分表明，在通过ExRCA技术制备获取的各种DNA功能材料中，功能化的非天然碱基与天然功能DNA部分能够互不干扰地发挥各自的功能，并实现优势互补和作用协同，从而极大地拓展了 DNA材料的功能化空间。最后，团队利用ExMRCA技术，成功构建了一种位点特异性交联的DNA功能性水凝胶。该水凝胶通过在ExMRCA过程中引入的氨基修饰的非天然碱基对和对应的交联剂实现精准的共价交联，其产物展现出了良好的结构整体性和稳定性。进一步实验的结果表明，该水凝胶能够直接应用于功能性RNA适配体的高效转录，证明了通过非天然碱基对进行的定点偶联对水凝胶中天然DNA序列的功能没有造成影响。相比传统DNA水凝胶中依赖DNA杂交或天然碱基化学偶联的交联方式，这一方法在交联的强度和空间精确性上都具有明显优势，从而为DNA材料的结构优化和功能拓展提供了新的思路和策略。

 综上，本研究建立的ExRCA与ExMRCA技术不仅为含非天然碱基DNA的高效扩增提供了新方法，也为DNA纳米结构的构建、超高灵敏度分子检测方法的开发及新型DNA功能材料的制备开辟了新路径。未来，这些技术有望进一步推动非天然碱基（对）在合成生物学、生物医学检测和材料科学中的广泛应用。

 该工作得到了广东省“珠江人才计划”引进创新创业团队（2019ZT08Y318）, 广东省“珠江人才计划”青年拔尖人才项目（2019QN01Y228），国家重点研发计划“合成生物学”重点专项（2019YFA0904102），国家自然科学基金面上项目（21978100），以及广州市科技局基础与应用基础研究项目（2023A04J1470）的资助。