陈庭坚教授课题组在Nucleic Acids Research上发表论文——酶促非天然核酸（XNA）的无模板合成及标记技术

 近日，华南理工大学生物科学与工程学院陈庭坚教授课题组在酶促非天然核酸（XNA）的无模板合成和标记技术开发上取得新突破，相关成果发表在国际著名期刊Nucleic Acids Research杂志（IF=16.6）上，题目为“Template-independent synthesis and 3′-end labelling of 2′-modified oligonucleotides with terminal deoxynucleotidyl transferases”。博士生孙乐平、硕士生向禹铭和副研究员杜宇辉为论文的共同第一作者，陈庭坚教授为唯一通讯作者，华南理工大学生物科学与工程学院为唯一单位。（论文链接：https://doi.org/10.1093/nar/gkae691）

 包括2′-修饰核酸在内的非天然核酸（XNA）作为新型的遗传信息存储介质，可以有效提高核酸分子的稳定性并拓展其功能和活性，在合成生物学、生物技术和生物医药等诸多领域展现出了巨大的应用潜力。为了充分利用XNA，高效的酶法合成和标记技术至关重要。前期工作已经对不同家族的DNA聚合酶和RNA聚合酶进行了分子改造，获得了能够识别并加工多种非天然底物的XNA聚合酶突变株，并基于此开发了一系列非天然寡核苷酸的酶法制备策略。然而，这些XNA聚合酶突变株对于XNA的合成大多依赖于DNA模板，使得XNA产物的获得需要额外的纯化步骤，这不仅增加了方法的复杂性和工作量，也限制了这类方法在更广泛场景下的应用。同时，对于XNA的高效、快速标记对于XNA在各个领域的广泛应用也是必须的。因此，开发不依赖于模板的XNA酶法从头合成策略及标记方法，成为了非天然核酸合成生物学领域的一个重要研究目标。

图1. 基于末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）的XNA无模板合成及标记技术

 在本工作中，课题组首先探索了能够不依赖于模板合成DNA的末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）对非天然底物的识别活性。测试并展示了三种代表性的TdT（即牛TdT，MTdT-evo和小鼠TdT）将三种代表性2′-修饰核苷三磷酸（2'-OMe-NTPs、2'-F-NTPs和2'-F-ara-NTPs）掺入单链DNA和双链DNA的3′末端的活性，并优化了MTdT-evo在单链DNA的3′末端掺入2′-修饰核苷三磷酸的反应条件。随后，课题组通过稳态动力学实验，对三种TdT在单链DNA的3′末端掺入2′-修饰核苷三磷酸的活性进行了深入系统的表征和比较。基于MTdT-evo对2′-修饰核苷三磷酸的优良活性，课题组开发了一种方便的单链DNA保护方法，能够有效增强单链DNA对核酸外切酶的抵抗力，大大拓展了单链DNA的应用场景。此外，课题组测试并展示了三种TdT在双链DNA的3′末端掺入2′-修饰核苷三磷酸的活性，并优化了MTdT-evo在双链DNA的3′末端掺入2′-修饰核苷三磷酸的反应条件。

 另外，课题组还对三种TdT在XNA的3′末端掺入含有天然或非天然碱基的核苷三磷酸的能力进行了测试和展示。利用TdT能够在2′-F-DNA的3′末端高效掺入天然核苷三磷酸的活性，建立了一种MTdT-evo介导的利用G四联体对2′-F-DNA的3′末端进行标记的方法。为了进一步优化XNA的标记技术并拓展其应用范围，课题组进一步测试并展示了三种TdT将含有功能化天然或非天然碱基的核苷三磷酸衍生物掺入不同XNA的3′末端的能力并对基于此的XNA标记进行了举例展示。最后，课题组利用MTdT-evo对2'-F-ara-NTPs的高效整合能力，成功构建了一种 DNA-FANA嵌合水凝胶，进一步拓展了TdT介导的不依赖模板的酶促XNA合成技术在合成生物学和新型生物材料开发领域的应用范围。

 该工作不仅为XNA的无模板从头合成和3′末端标记提供了高效简便的策略，也为开发新型生物材料提供了新的思路。文中建立的技术可以用于开发基于XNA的探针和生物传感器、XNA-小分子/大分子偶联物、新型XNA生物材料及以XNA为存储介质的稳定信息存储技术等。为XNA元件在合成生物学、生物技术、生物材料和生物医药等领域的全面应用提供了必需的工具和技术平台。

 该工作得到了广东省“珠江人才计划”引进创新创业团队（2019ZT08Y318）, 广东省“珠江人才计划”青年拔尖人才项目（2019QN01Y228），国家重点研发计划“合成生物学”重点专项（2019YFA0904102），国家自然科学基金面上项目（21978100），以及广州市科技局基础与应用基础研究项目（2023A04J1470）的资助。