6月9日，我院罗剑飞/林炜铁课题组在Water Research（IF=12.8）杂志上发表了一篇题为Sealing solid agar in serum bottles for rapid isolation and long-term preservation of chemoautotrophic ammonia-oxidizing bacteria的研究论文。硕士研究生吴家杰为第一作者，罗剑飞副教授和林炜铁教授为共同通讯作者，华南理工大学生物科学与工程学院为第一单位。论文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0043135424008170。

 化能自养氨氧化细菌（AOB）广泛分布于自然界，并在废水治理中发挥着重要的作用。由于生长缓慢、对环境因子敏感、种间关系复杂等特性，AOB菌株的分离纯化往往异常困难且耗时（据文献报道，仅有少数菌株通过固体平板分离，大多数通过液体dilution-to-extinction获得，其过程长达数年）。另外，AOB菌株也难以通过常规菌种保存方式保藏（低温易失活、干燥即失活），只能在常温条件下通过液体连续传代方式维持，而该过程又容易染菌，导致很多菌株在传代过程中丢失。由于难培养的特性，自1890年发现至今，AOB仅报道了3个属~21个种；然而，ATCC、DSMZ、JCM等菌种保藏中心仅有不超过7个种的保存记录，而国内菌种保藏中心鲜有相关记录。由于菌株和相关技术缺乏，国内基于AOB开发的具有自主知识产权的微生物菌剂一直处于空白（国外代表性产品/技术：诺维信、普罗生物技术等）。

 针对AOB菌株分离和保存过程中的难点，罗剑飞/林炜铁课题组开展了大量研究工作。前期研究中发现：AOB生长代谢受到Mg²⁺严重抑制，因而必须依赖伴生异养细菌对金属离子的吸附才能解除Mg²⁺抑制作用，这也导致了AOB细胞与异养细菌形成了类似“共生”的稳定关系，从而难以分离纯化；基于此，优化设计了一种低Mg²⁺含量的培养基，从环境中分离获得了多个AOB菌株（Science of the Total Environment, 2022, 838: 155923；授权专利CN202111071843.7）。

图1密封固体琼脂平板示意图及平板上形成的AOB单菌落.

 在前期研究基础上，本研究设计了一种密封固体琼脂平板：将琼脂装入血清瓶中制作固体平板，密封后将顶空中氧气控制于低浓度。利用该平板，从环境中快速（<30 d）分离获得了8个菌株，其中包括两个新种（16S rRNA基因相似性低于96%）；基于这些AOB菌株，发现氧气浓度越高越不利于它们在固体平板上形成单菌落（SCUT-1除外），有些菌株甚至无法在21%氧气浓度下形成单菌落；同样，液体培养时氧气浓度越低越有利于细胞生长，菌株SCUT-8在21%氧气浓度下没有氨氧化活性且不能生长。这些结果解释了为何利用密封固体平板可以更好更快地从环境中分离获得AOB菌株，特别是新种类群；同时也说明了为何难以利用传统的普通固体平板进行AOB的分离纯化。另外，利用该密封固体平板进行了AOB菌株的保存，发现在室温条件下保存10个月后，AOB菌株依然可以存活。

图2 AOB菌株在密封固体琼脂平板（上）和液体（下）的生长情况.

 该研究成果不仅为难培养氨氧化细菌的分离纯化和长期保存提供了一种新的技术，更发现了氧气对其生长代谢的影响，一定程度上颠覆了传统上对AOB的认识。目前，罗剑飞/林炜铁课题组在探讨该技术对氨氧化古菌（AOA）、完全氨氧化菌（CAOB）等其它难培养或未培养微生物分离纯化上应用的可行性。

 该研究得到了国家自然科学基金（41977034）和中央高校基本科研业务费项目（2022ZYGXZR040）的资助。