近日，华南理工大学生物科学与工程学院韩双艳课题组在Green Chemistry (IF 9.8) 期刊上，发表了一篇题为 “Development of high methanol tolerance Pichia pastoris based on iterative adaptive laboratory evolution”的研究性论文。该工作由华南理工大学生物科学与工程学院为第一单位，韩双艳教授为通讯作者，2021级博士研究生王帅为第一作者。（https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2023/gc/d3gc02874g/unauth)

甲醇作为一种环境友好型可再生能源，是生物制造中理想的碳一原料。然而，目前只有少量微生物能在低浓度甲醇下生长，甲醇代谢能力和转化效率尚不能达到工业生产的期望值。本研究旨在通过迭代式适应性进化——微生物液滴培养系统(MMC)和实验室摇瓶进化(SFC)联用，获得能够在高浓度甲醇中具有稳定性状和生长能力的毕氏酵母(P. pastoris)底盘细胞，并阐明其耐受机制，指导甲醇高耐酵母的定制与开发。

研究结果表明，经迭代进化后，WS026-4 (MMC-SFC)进化株在含10%甲醇的BMMY液体培养基和含13%甲醇的BMMY琼脂培养基中均能存活，在高浓度甲醇中保持较完整的细胞形态，表现出良好的生长性能。

图1 (A) GS115、WS026-4 (MMC)和WS026-4 (MMC-SFC)分别在甲醇浓度为6%、10%和13%的BMMY琼脂培养基上进行耐受性分析。(B) 初始甲醇浓度为6%时，GS115、WS026-4 (MMC)和WS026-4 (MMC- SFC)中的生物量和细胞死亡率测定。

进一步分析发现，WS026-4 (MMC-SFC)的细胞膜上磷脂的组成和相关基因的表达发生了较大变化。磷脂酰胆碱（PC）水平的大幅提高可能是WS026-4 (MMC-SFC)菌株表现耐受高浓度甲醇的一个重要因素。因此，我们尝试在野生型菌株GS115中过表达磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶2（PET2）基因，改造后的菌株可以在含8%甲醇的BMMY琼脂培养基上生长。这一发现表明，PET2是改善毕赤酵母甲醇耐受性的关键靶标之一。研究工作为将P. pastoris开发为细胞工厂、增强其甲醇利用转化能力、实现高值化学品生物制造提供了参考和借鉴。

图2 (A) 毕赤酵母中甘油磷脂的生物合成途径。(B) GS115、WS026-4 (MMC)和WS026-4 (MMC-SFC)中磷脂酰乙醇胺(PE)，磷脂酰胆碱(PC)和心磷脂(CL)的含量测定。(C)甘油磷脂的生物合成途径中关键基因表达量的变化。(D) GS115-PET2的菌株在4%和6%甲醇浓度的BMMY培养基中生物量的变化。(E) GS115和GS115-PET2的菌株分别在甲醇浓度为6%和8%的BMMY琼脂培养基上的耐受性分析。

本论文得到了国家重点研发计划[2018YFA0901500]和国家自然科学基金项目的资助(No.31771958)。