近日，华南理工大学生物科学与工程学院陈庭坚教授课题组在非天然碱基DNA酶促合成技术的开发中取得新进展，相关成果又发表在期刊ACS Synthetic Biology上，题为：One-Pot Enzymatic Preparation of Oligonucleotides with an Expanded Genetic Alphabet via Controlled Pause and Restart of Primer Extension: Making Unnatural Out of Natural，硕士生曹懿君为论文的第一作者，博士生白静思、硕士生邹金容、副研究员杜宇辉为共同作者，陈庭坚教授为通讯作者，华南理工大学生物科学与工程学院为唯一单位（论文链接：https://doi.org/10.1021/acssynbio.3c00258）。
图1. 一锅法非天然碱基DNA酶促合成技术
非天然碱基对（unnatural base pair，UBP）的开发极大地拓展了生命的遗传字母表，显著增加了DNA及RNA分子的遗传信息储存容量，在兼容中心法则的同时又增加了遗传分子的功能性和多样性。在具有代表性的非天然碱基对中，dNaM-dTPT3 及其类似物已经被成功应用于具有功能性六碱基基因组的半合成生命体（semisynthetic organism，SSO）的构建，并开始在生物技术和生物医药应用中崭露头脚。目前，非天然碱基对的开发和人工生命的构建与应用是合成生物学世界最前沿的研究方向之一，也是化学合成生物学的代表性研究方向之一。随着非天然碱基对在体内外各种应用研究的逐渐深入，人们对于非天然碱基DNA的需求也随之迅速增加，而利用传统化学固相合成法获取非天然碱基DNA的方法存在着很大的局限性，无法用于日常若干非天然碱基DNA的快速制备。为解决这一矛盾，课题组前期已经建立了基于末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）的第一代非天然碱基DNA酶促合成技术（ACS Synthetic Biology, 2022, 11: 4142-4155）和基于噬菌体DNA聚合酶和DNA连接酶的第二代非天然碱基DNA酶促合成技术（ACS Synthetic Biology, 2023, 12: 2676-2690），实现了非天然碱基DNA片段的高效酶法制备。
在本工作中，课题组利用Klenow fragment (exo-)DNA聚合酶介导的引物延伸可控式暂停和重启，建立并优化了第三代非天然碱基DNA酶促合成技术，实现了含非天然碱基dNaM或dTPT3的DNA 寡核苷酸链的一锅法快速制备（图2）。该方法主要包括两个步骤：（1）以天然DNA为模板的单一非天然碱基酶法插入和引物延伸暂停；（2）使用dNTPs重启引物的延伸以获得全长产物。
图2. 第三代（一锅法）非天然碱基DNA酶促合成技术的设计及应用
为建立该技术的第一步，课题组首先选定了2 种A 族DNA聚合酶（Kf (exo-)DNA聚合酶和Taq DNA 聚合酶）和3 种B 族聚合酶（Q5 高保真DNA 聚合酶、Deep Vent DNA聚合酶和KOD FX DNA聚合酶），并利用引物延伸策略分别验证了不同DNA聚合酶对非天然碱基的错配插入活性。实验结果显示，Kf (exo-)DNA聚合酶展现出良好的dNaM/dTPT3-天然碱基错配合成活性。进一步进行的插入反应条件优化则将单个非天然碱基的插入效率提升到了100%（图3）。
图3. A族DNA聚合酶Kf (exo-)催化的基于非天然核苷三磷酸插入的引物延伸及反应条件优化
随后，为建立该技术的第二步，课题组验证了不同聚合酶催化非天然碱基错配插入后使用dNTPs的引物延伸活性。实验结果表明，Kf (exo-)DNA聚合酶具有最优的错配后引物延伸活性。通过系统地优化反应条件，获得了较高的反应效率和全长产物纯度（图4）。
图4. 错配插入非天然碱基后的引物延伸及反应条件优化
基于以上实验结果，课题组建立了基于Kf (exo-)DNA聚合酶的一锅法酶促DNA合成技术，通过非天然碱基错配插入和错配后延伸两步快速、方便、高效地合成含有非天然碱基的DNA寡核苷酸链（图5）。
图5. 基于Kf (exo-)DNA聚合酶的一锅法酶促非天然碱基DNA合成技术的建立及测试
随后，课题组通过凝胶迁移实验和测序分析对酶法制备的非天然碱基DNA的纯度和质量进行了测试。结果表明，使用该方法制备获取的非天然碱基DNA具有优异的纯度和质量，可以完全替代化学固相合成法生产的非天然碱基DNA，并直接应用于各种应用场景（图6）。
图6. 一锅法制备获取的非天然碱基DNA片段的表征及应用展示
最后，课题组对该方法制备在非天然碱基上下游具有不同序列的DNA链的通用性进行了测试。结果显示，酶促合成过程中的非天然碱基插入和错配延伸效率均未受到非天然碱基邻域序列的明显影响，制备获得的具有不同序列的非天然碱基DNA产物均具有良好的纯度和质量，从而证明了本方法具有优良的通用性（图7，8）。
图7. 一锅法非天然碱基DNA酶促合成技术制备含有非天然碱基dNaM和不同序列的DNA寡核苷酸链的方法通用性测试
图8. 一锅法非天然碱基DNA酶促合成技术制备含有非天然碱基dTPT3和不同序列的DNA寡核苷酸链的方法通用性测试
综上，本研究建立并优化了基于Kf (exo-) DNA聚合酶的一锅法非天然碱基DNA酶促合成技术。该方法仅使用两种天然DNA 寡核苷酸链、稳定的非天然核苷三磷酸盐、Kf (exo-) DNA聚合酶和实验室中的其它常用试剂即能够实现在单个试管中合成任意含非天然碱基的DNA 寡核苷酸链。全过程仅需不到4个小时，在普通水浴锅中即可完成。产物可直接应用于构建含有非天然碱基对的质粒或基因组DNA（用于在活细胞内进行非天然碱基对的复制、转录和翻译）、组装含有非天然碱基对的无细胞转录和翻译DNA模板（用于无细胞转录含非天然碱基的RNA或翻译含非天然氨基酸的蛋白质）、制备通过非天然碱基DNA或RNA的指数富集的配体系统进化技术（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX）等实验获取的单一含非天然碱基的DNA或RNA序列（用于单一含非天然碱基序列的活性测试和筛选）。由于其简易性、高效性和通用性，该方法将极大地促进非天然碱基对在体内外的应用及半合成人工生命的开发和应用，并为六进制DNA信息存储系统的开发进一步奠定技术基础。
该工作得到了国家重点研发计划“合成生物学”重点专项（2019YFA0904102），国家自然科学基金面上项目（21978100），广东省“珠江人才计划”青年拔尖人才项目（2019QN01Y228），以及广东省“珠江人才计划”引进创新创业团队（2019ZT08Y318）的资助。
