近日，华南理工大学生物科学与工程学院王菊芳教授课题组在合成生物学及代谢工程主流期刊Metabolic Engineering (1区，IF=8.829)上发表了一篇题为“De novo biosynthesis of butyl butyrate in engineered Clostridium tyrobutyricum”的研究论文。该论文报道了以酪丁酸梭菌为底盘细胞，在不添加任何前体化合物和脂肪酶的前提下，实现以葡萄糖或甘露醇为碳源从头合成丁酸丁酯。博士研究生郭晓龙为该文第一作者,王菊芳教授和傅宏鑫副教授为共同通讯作者，华南理工大学生物科学与工程学院为唯一单位（论文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717623000496）。

丁酸丁酯是市场容量巨大的基础化学品和精细化工品，广泛应用于食品、化妆品、制药、化工以及生物燃料等领域。传统法生产脂肪酸酯是在高温条件下通过浓硫酸催化无机酸和醇通过酯化反应生成相应的酯。随着石化资源的日益枯竭、传统能源消耗对环境污染的日渐加重以及大众对生物基化学品的偏爱，利用工业微生物作为“细胞工厂”，以可发酵糖为底物生产生物基脂肪酸酯具有巨大的应用前景。

图1构建酪丁酸梭菌细胞工厂实现丁酸丁酯从头合成

酪丁酸梭菌缺乏合成丁醇和丁酸丁酯的能力，该研究通过在基因组上过表达外源醛醇脱氢酶构建丁醇合成途径，为丁酸丁酯合成提供前体；然后通过醇酰基转移酶（AAT）的筛选及启动子优化，成功构建丁酸丁酯从头合成途径。为了进一步提高前体物质丁醇和丁酰-CoA的供给，使用强启动子强化丁醇合成途径，在基因组上过表达CoA转移酶促进丁酰-CoA供应，从而获得具有丁酸丁酯高效合成能力的优良菌株MUV3。最后选择以具有较高还原度的甘露醇为碳源，在5-L发酵罐分批补料发酵模式下，丁酸丁酯的产量、得率和选择性分别达到62.59 g/L、0.21 mol/mol和95.97%，为目前微生物从头合成丁酸丁酯的最高水平。

图2 构建upp/5-FU反筛选系统

此外，由于缺乏成熟的遗传操作工具，难以酪丁酸梭菌中引入多酶代谢途径或进行多基因迭代编辑，阻碍了对酪丁酸梭菌的深入研究及应用。因此，该研究还针对酪丁酸梭菌的内源CRISPR敲除系统进行优化升级，构建了基于酪丁酸梭菌的upp/5-FU（5-氟尿嘧啶）反筛选系统，实现了敲除质粒的快速消除，从而实现基因的迭代编辑，为酪丁酸梭菌中合成生物学技术的发展奠定了基础。

该研究得到了国家自然科学基金（22178133，21808069）、广东省科技计划项目（2019A050510008）和广州市基础与应用基础研究（202102020281）的资助。