近日，华南理工大学生物科学与工程学院陈庭坚教授课题组在非天然碱基DNA的制备和应用技术开发方面取得新进展，相关成果发表在期刊ACS Synthetic Biology上，题为：Enzymatic Synthesis of DNA with an Expanded Genetic Alphabet Using Terminal Deoxynucleotidyl Transferase，博士研究生王光远为论文的第一作者，硕士研究生何传平、邹金容、科研助理刘家韵、副研究员杜宇辉为共同作者，陈庭坚教授为通讯作者，华南理工大学生物科学与工程学院为唯一单位。（论文链接：https://doi.org/10.1021/acssynbio.2c00456）
图1: 具有拓展遗传字母DNA的酶促合成及应用
化学合成的非天然碱基对极大地拓展了生命的遗传字母表，并且在生物技术和生物医药等领域展现出了巨大的应用潜力。其中，非天然碱基对dNaM-dTPT3及其类似物更是被成功应用于世界上首个DNA含有六种碱基的半合成生命体的构建，从根本上改变了整个生命进化的历程。含有非天然碱基的寡核苷酸链的高效合成是全面利用这些非天然碱基对的先决条件，而利用传统化学固相合成技术制备含非天然碱基的寡核苷酸链的方法则具有诸多的局限性，难以满足快速发展的非天然碱基对和人工生命的开发和应用需求。近年来，基于末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）的酶促DNA合成技术在诸多方面克服了传统固相DNA合成技术的局限性，已经逐步发展成为极具潜力的新一代DNA合成技术。但是，在本项研究工作之前，还未有过利用TdT合成制备含有非天然碱基dNaM和dTPT3的DNA的探索及应用研究。
在该项研究中，课题组首先探索发现了小牛胸腺来源的TdT对于非天然核苷三磷酸dNaMTP及dTPT3TP具有一定的识别活性，接着通过对反应条件的全面系统优化，使TdT对于dNaMTP及dTPT3TP的整合活性有了显著的提高，从而实现了基于TdT的含有非天然碱基dNaM或dTPT3的寡核苷酸链的高效合成。
图2: 天然以及非天然碱基对的化学结构及TdT催化的利用天然以及非天然核苷三磷酸的引物延伸
通过进一步的研究，课题组还发现在优化条件下，TdT对于含有非天然碱基dTPT3衍生物dTPT3Am和dTPT3Biotin的各种非天然核苷三磷酸也具有非常好的整合活性，并在此基础上开发出了一系列对各种功能性DNA进行正交标记的技术，实现了在完全不影响这些DNA原有功能的基础上对它们进行高效的荧光和生物素等标记。
图3: TdT介导的基于功能化非天然碱基的DNA正交标记
最后，基于TdT对于非天然核苷三磷酸dNaMTP及dTPT3TP的高效识别活性，课题组还开发了一种酶法制备序列内部任意位点含非天然碱基对的DNA的策略。该策略使实验室日常快速获取含有非天然碱基对的任意DNA成为可能，对于全面推广非天然碱基对和人工生命的开发和应用研究具有重要价值。
图4: 序列内部含非天然碱基对DNA的酶法制备策略
综上，本研究建立了基于TdT的含有非天然碱基（对）及其衍生物的DNA的酶促制备技术，对于非天然碱基（对）和人工生命的开发和应用具有重要意义和价值，也为未来六进制的DNA信息存储奠定了技术基础。
该工作得到了国家重点研发计划“合成生物学”重点专项（2019YFA0904102），国家自然科学基金面上项目（21978100），广东省“珠江人才计划”青年拔尖人才项目（2019QN01Y228）以及广东省“珠江人才计划”引进创新创业团队（2019ZT08Y318）的资助。
